De orígenes humildes, se enroló en una compañía de cómicos ambulantes y recorrió todo México. En el circo desarrolló todo tipo de trabajos, entre ellos interpretar pequeños papeles.

A finales de los años veinte comenzó a actuar en los locales de Ciudad de México y creó la imagen prototípica con la que se haría famoso. En 1930 era ya el cómico más famoso del país. En 1934 conoció a la actriz de origen ruso Valentina Subarev, con quien contrajo matrimonio y tuvo a su único hijo, Mario Arturo.

En 1936 debutó en la película No te engañes corazón, a la que siguieron Así es mi tierra y Águila o sol (1937), El signo de la muerte (1939) y toda una serie de cortometrajes. 

La consagración le llegó en  1940, en el filme Ahí está el detalle  en cuya última escena y mediante su delirante discurso, Cantinflas se salta las convenciones sociales, logrando cambiar el veredicto del juez.  A partir de su debut como protagonista en la película Ahí está el detalle el actor, con sus casi cincuenta filmes, batió récords de recaudación en las salas de exhibición hispanoamericanas durante tres décadas seguidas.

Su popularidad se basó luego en películas como  Ni sangre ni arena  y El gendarme desconocido (1941), en las que descubrió a su director ideal, Miguel M. Delgado 

En 1944 entró a formar parte del Sindicato de Trabajadores de la Industria Cinematográfica (Stic), fundado en 1919 con el nombre de Unión de Empleados Confederados del Cinematógrafo. Su aportación fue decisiva en la mejora de las condiciones de contratación del personal de los estudios, pues encabezó una proyectada huelga, secundada por Jorge Negrete y Arturo de Córdova.

En los años cincuenta, sus cintas muestran un cambio: del personaje de la picaresca urbana y popular sólo quedaría un humor basado en el uso reiterativo del “cantinflismo”, la habilidad para hablar mucho y no decir nada. En todas ellas, Mario Moreno se convirtió en un portador de juicios y críticas contra la sociedad “pueblerina”, en particular, y contra la humanidad, en general.

De este modo, arremetió con singular hincapié contra la “aristocracia desnaturalizada”, haciendo que triunfara lo auténtico sobre lo falso. Se constituyó en el hombre que siempre decía la verdad, aunque en forma sarcástica, y sufrió las consecuencias de esa fidelidad a sí mismo.

Excepcionalmente, participó en la superproducción estadounidense La vuelta al mundo en ochenta días (1957). La película obtuvo una buena acogida, que propició que el actor rodara luego Pepe, dirigida por George Sidney en 1960. El fracaso del filme decidió a Mario Moreno a no volver a probar fortuna fuera de las fronteras de su propio país, con la única salvedad del largometraje español Don Quijote cabalga de nuevo, dirigido por Manuel Delgado, con quien había trabajado en filmes como El bolero de Raquel (1956) y El padrecito (1965), el primer largometraje que el actor rodó en color.

Si en sus interpretaciones denunciaba las desigualdades sociales y la insolidaridad, en la vida real realizaba obras caritativas y llegó a montar una oficina para los necesitados. La última etapa de su vida, después de enviudar en 1966, estuvo marcada por su participación en actos sociales y políticos (incluso llegó a pronunciar un discurso en la Asamblea de las Naciones Unidas).